(1．宜兴市第二人民医院药剂科江苏宜兴214221；2．江苏弘惠医药有限公司研发部)

何首乌为蓼科植物(Polygonum multiflorum Thunb．)的块根，生用能解毒消痈、润肠通便，制用补肝肾、益精血、乌须发。现代化学和药理研究证明，何首乌主要含二苯乙烯苷、羟基蒽醌类、磷脂、淀粉类成分，具抗衰老、降血脂、抗动脉硬化，增强免疫功能等作用，其中二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分，具有抗氧化清除自由基，延缓衰老，增强记忆，降低胆固醇，保肝等多重功能，作为抗衰老的指标组分极具研究的价值。超临界流体萃取(SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除了可以减少有机溶剂使用外，还具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶媒便于挥发、提取物较为干净、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的萃取方法。本文建立了SFE—HPLC法分离测定何首乌中的有效成分二苯乙烯苷，为何首乌及其制剂的质量控制提供方法学依据。

1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-5OOB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；真空干燥箱(上海市实验仪器厂)；二苯乙烯苷对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号：110844-200505)，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯，何首乌药材由北京绿野药材公司提供，由中国药科大学李会军老师鉴定。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙睛-水(20:80)；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：320nm；柱温：室温 。

2．2 标准曲线的建立

分别精密吸取浓度为0.10 mg·ml-1的二苯乙烯苷对照品溶液2，5，10，15，20μl，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，二苯乙烯苷的量(g)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程：Y=3.50×1O3X—154，r=0.999 9(n=5)，结果表明二苯乙烯苷在0.2~2.0μg范围内线性关系良好。

2．3 精密度试验

取标准曲线项下对照品溶液，重复进样5次，每次5μl，对照品峰面积积分值的RSD为1.02％ 。

2．4 回收率试验

取5份已测定含量的同一何首乌样品液，分别准确加入二苯乙烯苷对照品适量，在选定色谱条件下进样并计算，结果二苯乙烯苷平均回收率分别为102.4％(RSD为1.73％)。

2．5 萃取物有效成分含量的测定

将萃取物减压加热挥去溶剂并定量，加入计量的稀乙醇，加热使萃取物溶解，定量，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液进样。采用高效液相色谱仪作定量分析。(对照品、样品色谱图见图1)。三批样品测定结果分别为6.376、6.385、6.369 mg·g-1。

2．6 二苯乙烯苷超临界CO2萃取条件确定

影响超临界流体萃取的因素较多，试验表明萃取的温度、压力、时间和改性剂用量的选择是影响超临界萃取效果的关键所在，为此本试验选取这4个主要因素作为考察对象，以二苯乙烯苷的提取率作为考察目标，按照正交设计L9(34)进行试验，试验的因素、水平见表1。

具体方法为：取干燥粉碎的何首乌粗粉400 g，装入萃取釜里，密封。设定萃取、分离所需温度、流量，打开萃取器、分离器和系统的其他加热装置，进行系统预热，启动高压泵，加人一定量的改性剂。打开CO2进气开关，启动压缩机，使压力达到所要求的范围，保持一定的时间，打开分离釜I、分离釜Ⅱ，进行分离操作，分别收集萃取分离的生首乌有效成分。含量测定结果表见表2，方差分析表见表3。

以何首乌中有效成分二苯乙烯苷的得率为考察指标，由统计软件的分析结果可以看出，各因素作用的显著性次序依次为：A>B>D>C，在正交表选择的各因素中，萃取压力对有效成分的影响最大，同时萃取温度对二苯乙烯苷的收率也有显著性影响。萃取时间对收率影响不显著，可作为方差分析的误差项。根据方差分析结果，可得最佳工艺条件为A3B3C2D1，即萃取压力40 MPa，萃取温度60℃ ，萃取时间2h，夹带剂95％乙醇量为生药的20％ 。在此最佳工艺中，提取物干膏中二苯乙烯苷含量可达6.387％ ，提取转移率为79.45％。

验证实验：取干燥粉碎的何首乌粗粉400 g，按正交试验所得最佳工艺(萃取压力40 MPa，萃取温度60℃ ，萃取时间2 h，夹带剂95％ 乙醇量为生药的20％)提取药材中二苯乙烯苷，所得萃取物干燥后采用高效液相色谱法色谱法测定，结果二苯乙烯苷纯度为6.192 mg·g-1，说明该最佳工艺重复性好，稳定可行。

3 讨论

应用超临界萃取法是当前中草药有效成分提取方法的发展方向，超临界CO2萃取技术以其萃取效率高、纯度好、节约能耗、生产成本低的特点，在中医药领域有着广泛的应用前景。何首乌中二苯乙烯苷见光易分解，在高温、强碱性条件下不稳定，而采用超临界萃取法提取二苯乙烯苷可避免以上问题。

何首乌药材粒度大小对萃取效果有一定的影响，超临界流体萃取的过程存在一个溶解速率和溶解度的问题，粒度大，溶解速率相对较慢，粒度小，溶解速率相对较快。通过预试，对不同粉碎度的何首乌中二苯乙烯苷的含量测定，发现粉碎度较大的何首乌中二苯乙烯苷的含量较高，而未粉碎的何首乌含量较低。这提示，要保证制剂质量，选择适当粉碎度的药材是必要的。

在萃取苷类成分时，夹带剂的选择和用量是比较关键的。预实验发现，在不加夹带剂的情况下，几乎没有二苯乙烯苷被提取出来。以95％乙醇为夹带剂，易于回收，不存在溶剂残留的问题。在萃取过程中，以副泵的调频来控制夹带剂的泵入速度和用量。超临界CO2萃取后，原料的性状、结构、形态几乎没有任何改变，可以继续提取超临界不适合的组分，为中药资源的合理开发利用提供了新方法。