石陆娥1,2 应国清2 唐振兴1 易其喻2 熊文说
（1. 浙江工业大学化学工程与材料学院；2.浙江工业大学药学院：杭州 310014）
在超临界条件下，温度和压力的改变可以影响流体的密度，因此诸如一些由密度决定的常数如介电常数，溶解度等就能很好地控制。对于工业生产可以使生物催化反应和产物的分离同时进行，实现偶联操作，在许多的情况下，酶催化反应在有机溶剂中因为反应太慢而不能应用于工业化大生产。但是在超临界流体中，由于它很小的传质阻力，使得反应能很快进行，而且有机溶剂在超临界流体（SCF）中的溶解能力很好；同时它的下游处理和溶剂回收也更加方便。对手性化合物合成和外消旋体拆分的则是良好反应体系。
正是这些优点，使得超临界流体技术在酶催化反应等领域得到了广泛应用。在酶催化反应中，目前研究的较多的流体有乙烷、乙烯、三氯甲烷、六氟化硫和CO2等，其中CO2是应用的最广泛的流体，CO2安全、无毒，它的临界温度为31.1℃，接近室温，可以使热源性物质不会因为温度的关系而变性或失活；而且临界压力为7.4MPa，适宜工业化大生产。
1 影响因素
1.1 介质水含量
实验表明，超临界条件下的酶催化反应体系中固相（酶及载体）必须含有水，哪怕只是薄薄的一层水分子覆在酶表面，水的存在是为了维持酶的活性及其构象。Randolph对于胆固醇氧化酶中的水含量研究发现，如果系统中没有水的话，酶活将只有有水时候的10％，然而一旦加入1％（体积分数）的水进入系统后，胆固醇氧化酶的活力又恢复了。
如果加入了比较多的水，正如R Goddard等人报道，在超临界CO2中油酸和乙醇的酯化反应中，当水含量达到15％（质量分数）时，酶活力最高，继续加水则酶活力下降，他们解释为过多的水在酶附近会形成亲水性障碍层使得酶活力降低。到底多少的系统含水量才最合适呢？Condoret等人认为在SC CO2中脂肪酶催化反应的最佳水含量为8％~12％（质量分数）。主要有4个因素影响最佳水含量。
（1）所用流体的极性。Domont报道在SC CO2和乙烷中脂肪酶催化十四烷和乙醇的反应,在CO2中最合适水量比在乙烷要大几十倍。他认为这是由于CO2的亲水性比乙烷强。同样Kamat等人实验表明，亲水性的溶剂趋向于将水从酶和载体中拉到溶剂中，所以在酶催化反应中，最大的酶活往往是在疏水性溶剂中达到的。
（2）酶的载体。Condoret等人研究了水在超临界CO2和不同的载体的分配关系，结果表明，由于实验环境对其平衡有很大的影响，所以不能很精确地估计流体中有多少水含量，载体有多少水。Bosley等人也认为载体与酶表面的结合水有关系，并且指出在相同的水含量下，酶在亲水性载体表现出较小的活性。这与Kamat的观点类似。
（3）酶催化反应类型。在酯化反应中，水是生成物，而在水解反应中水却是反应物被消耗。因此在不同类型反应中最佳水含量是肯定不同的，学者们的实验也证实了这个观点。Dumont报道在超临界乙醇中十四烷酸的反应（12.5MPa，323K）中，只有系统中含水量很大时，才会达到最大的反应速率；Miller等人研究了在超临界CO2中十四烷酸同甘油三月桂酸酯的反应（9.5MPa，308K），他们认为只有当系统的含水量很低的时候才有较高的酶活。Srivastava等人也持同样的观点，他们在超临界CO2进行了肉豆蔻酸的酯交换反应，发现水的添加会导致肉豆蔻酸的酯化率呈指数级的下降（图1）；他们为此将CO2气体通过硅土床，从而使得含水量减少，酯化率也从19％上升到22％。
（4）水的添加方式。Steytler在SC CO2下（30MPa，40℃），用Candida脂肪酶催化丁酸和月桂酸的合成，发现在反应器填充完全后再加水到催化剂床层上，酶活将会比较高；如果是直接将水加入到容器中和酶充分接触，那么酶活会很低。
另外有学者认为系统含水量对于最初反应速率及酶活和稳定性有一定的关系Nakamura在超临界CO2和n-hexane中,发现当水含量不足1％（质量分数）时，最初反应速率并没有因为流体的不同而有差异，但是系统中的含水量超过了20％（质量分数）后，在CO2的最初反应速率要比在n-hexane中大4倍。Ma人ty对于固定化酶的研究发现，如果系统中含有水，那么酶的稳定性将会下降。但是也有学者有相反的观点。Sovova等人在SC CO2中黑醋栗油的酶催水解反应发现，CO2中的水含量对于反应速率几乎没有影响。
1.2 温度和压力
如前所述，温度和压力的微小改变会导致流体的密度大幅度的改变，从而改变流体的物理性质及反应机制，但对于酶活及酶本身的选择性和稳定性也都有影响，在临界点附近这种影响更加明显。Matsuda等人在SC CO2中通过改变温度和压力从而改变3-氟甲基对氯苯基甲醇的立体选择性的酶催化反应，这个结果符合Eyring 关于温度对于物质的立体化学结构影响的理论。Srivastava研究了温度从30℃到75℃对于该催化反应的影响。他们实验结果表明，酯化率由35℃时的12％上升到45℃的19％，但是随着温度的持续上升，酯化率却下降，直到70℃的3％。他认为这不是酶失活的原因，因为同是这个酶在超临界CO2下十二酸酯的水解反应中，在,65℃下有最高的水解率，在超临界CO2下酶的稳定性还是很好的。kamat等人证实了压力对于超临界三氟甲烷流体的物理性质的影响，即每当增加13.8MPa就会导致4％的三氟甲烷的介电常数的提高。Eyring等人认为压力对于反应机制也是个影响因素，并且他们还提出了Eyring形态转变理论，用来解释压力对于反应速率的影响。Oliveira在SC CO2流体下用脂肪酶催化棕榈油的反应表明，最初反应速率（％/min，丙三醇质量分数） 从6MPa的13.09％提高到9MPa的28.15；但是继续增加压力，反应速率急剧下降，在20MPa时只有6.66。他认为在SCF中的酶催化反应的最大反应速率应该在流体的临界点附近。
Chaudhary等人指出随着超临界三氟甲烷的压力的改变，枯草杆菌蛋白酶的活力和选择性也会大幅度的变化，原因是压力的变化改变了溶剂的物理性质，而酶的结构没有发生改变。Randolph也有同样的观点，通过核磁共振谱图发现，在SC CO2流体下，压力对于胆固醇氧化酶的结构几乎没有影响。
但是也有学者认为正是压力的改变诱导了酶的结构和功能的变化，从而导致了酶活的改变。
1.3 底物及产物含量
Srivastava在该实验中发现，如果底物（乙醇）用量过多的话将会导致酶的催化能力的弱化。R Goddard也有同样的观点，他认为当亲水性的底物如乙醇加入的量过多，会改变水在超临界流体中的分配，使得固定化酶中的水分丢失以至酶活减少。
Endo Yasushi认为在超临界流体酯交换反应过程中，如果选择性的把反应产物分离出反应体系中，那么可以提高酯交换率。 陈惠晴在超临界CO2中用假丝酵母脂肪酶催化月桂酸和正丁醇反应，她发现当正丁醇浓度小于100mmol/L，反应速率随着浓度的增加而提高，但是正丁醇浓度从100mmol/L增加到400mmol/L， 反应速率下降了60％。
1.4 夹带剂
有机溶剂在超临界流体中的溶解能力很好；如果是极性有机物在非极性的流体中反应，那么它的溶解度就很小了，使得反应速度减慢。为此，采取了添加极性夹带剂（乙醇、水等）的方法。Randolph研究表明乙醇能明显提高酶催化反应速率。Capewell在3-羟基酯的酶催化反应中添加了丙酮、癸烷等夹带剂，发现它们对于反应并没有太大的影响，只有癸烷能提高对映体过量值（ee）及转化率。在实际的大生产中，夹带剂的添加将会使得产物的分离变得更加复杂，并且有可能有副产物的生成。因此应根据实际生产决定合适的夹带剂。
2 反应机理
超临界流体的特殊性质决定了它的反应机理的复杂性。Kamat认为，甲基丙烯酸甲酯和乙基己醇的反应在所有非水体系的反应机理应该是大致相同的。他认为在超临界乙烷中该反应可以用米氏方程来表示，并且还符合底物（乙基己醇）抑制的Ping-Pong Bi-Bi机理。他解释这可能是酶首先和底物生成不可逆的复合物，或者是和甲基丙烯酸甲酯（MMA）生成复合物，这种复合物能和甲醇形成一种酰酶的中间产物，这个中间产物随后和底物生成二元复合物，使得它能够分离出产物和游离酶。R Goddard，Marty和Dumont等人也有类似的观点。其中R Goddard还发现当底物（乙醇）的量为150mmol时，表现为竞争性抑制反应，当乙醇的量为300mmol，那么就表现为非竞争性抑制反应了。Marty也建立了在超临界CO2中油酸和乙醇反应的合适模型。
3 在合成和拆分手性药物上的应用
手性药物的制备已经成为世界医药领域新的研究热点，学者们分别采用不同的方法来得到具有生物活性的手性化合物。由于旋光异构体之间的物化性质太相近，用传统的合成后再拆分的方法效果不是很好。酶的高度区域选择性和立体专一性，决定了在这一领域酶催化反应具有广阔的应用潜力。
许多文献报道，在传统的有机溶剂酶反应就有很好的立体选择性，所以在超临界流体下的立体选择性还没有更多的阐明。很多的情况下，在超临界流体中进行手性药物的合成比在有机溶剂中的效果更好，有的ee值甚至达到了99％。如Mase等人指出，丙二酸二乙酯的酶催化反应如果在己烷等6种不同有机溶剂中进行，那么ee值几乎为0；而在SC CO2中，ee值可以达到50％，同时转化率也达到了41％。他解释这是因为酶的活性部位在超临界条件下随着压力的变化发生了结构转变。根据这个设想，他推出了这个反应的对映体选择性可能机制。
Hartmann等人也认为在SC CO2中的立体选择性要比在己烷中好，他认为在己烷中酶的失活与氨基甲酸盐有一定的关系。另外有许多学者就温度、压力以及底物浓度等参数对于对映体选择性的影响进行了研究。
如表1，在合成和拆分手性化合物的应用方面，学者们的研究主要集中在超临界CO2和脂肪酶。因此，开发出新的高效的流体和酶使之更好地应用于实际大生产中将是今后的研究目标。
4 结束语
超临界流体作为一种独特的非水反应介质，与有机溶剂比较它有许多的优点，它可以替代许多的有机溶剂。目前，大部分工作只停留在实验研究，而且流体和酶的选择过于集中。因此，如何使得这项技术应用于实际的大生产尤其是在手性药物合成和拆分方面的应用将是今后研究的方向。