摘要:正交实验法优化了超临界CO2 萃取香椿叶总黄酮的工艺。在原料50 g,分离室Ⅰ温度35 ℃、压力7 MPa;分离室Ⅱ温度35 ℃、压力与储罐平衡条件下,超临界CO2 萃取香椿叶中总黄酮的最佳工艺条件为:萃取压力30MPa,萃取温度45 ℃,萃取时间215 h,夹带剂用量为3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用无水乙醇、后3次用体积分数为85%的乙醇做夹带剂。在此条件下1 g香椿叶中提取的总黄酮质量为81836 9 mg,总萃取率为51106% ,提取物以总黄酮计的清除2, 22二苯代苦味酰基苯肼基(DPPH)自由基的IC50为51080 g•g- 1。
关键词:香椿叶;总黄酮;超临界CO2 萃取;夹带剂;中药现代化。
香椿Toona sinensis (A. Juss. ) Roem 属楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)落叶乔木[ 1 ] ,材菜兼用,在我国具有悠久的栽培历史[ 2 ] ,不但是我国特有速生用材树种[ 3 ] ,而且被国外称为“绿色保健菜”[ 4 ] 。研究发现香椿叶含有黄酮类化合物[ 5 ] 。生物类黄酮具有心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性,以及抗炎、镇痛、保肝等多种生物活性[ 6 ] ,特别是具有抗自由基及抗癌、防癌作用,使生物类黄酮在医药、食品领域的应用具有广阔的前景。因此,黄酮的提取制备技术的研究具有重要意义。
超临界流体萃取( SFE)是利用超临界流体对中药及天然药物有效成分进行提取分离的新型技术,与传统分离提取方法相比,具有产品纯度高、收率高,有效成分破坏少,操作简单、节能等优点,还可通过控制临界温度和压力的变化达到选择性提取和分离纯化的目的。超临界CO2 萃取,已应用于提取柿叶黄酮[ 7 ] 、藜蒿黄酮[ [ 8 ] 、甘草黄酮[ 9 ] 、银杏叶黄酮[ 10 ]等,显示该技术有良好应用前景。
作者研究了超临界CO2 提取香椿叶中总黄酮的工艺条件和提取物清除DPPH自由基的能力。在单因素实验的基础上,采用正交实验方案,以总黄酮得率为主考察指标,提取物以黄酮计的清除DPPH自由基的IC50值为次考察指标,对香椿叶总黄酮的超临界CO2 单次提取工艺进行了优选,结合提取次数实验,确定了香椿叶总黄酮的超临界CO2 提取工艺。 材料与方法
1．1、仪器、试剂与材料
仪器: HA121 - 50 - 01 型超临界CO2 萃取装置,江苏省南通市华安超临界萃取有限公司; UV /V IS2802PCS型分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司; 7230G可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司; SH IMADZU AY120 型电子分析天平,岛津国际贸易(上海)有限公司; ES - 600型电子天平,长沙湘平科技发展有限公司; pHS - 3C型精密pH计,上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂。试剂: 2, 22二苯代苦味酰基苯肼基(DPPH) , C18H12N5O6 ,相对分子质量394133, Sigma - Aldrich公司;芦丁,四川光泰制药有限公司;体积分数95 %乙醇,三氯化铝,醋酸钠,冰醋酸均为国产AR;食品级CO2 ,长沙高科气体有限公司; 水为自制新鲜蒸馏水。 材料:所用香椿叶于2005年11月下旬采自中南林业科技大学株洲校区,由中南林业科技大学刘克旺教授鉴定为Toona sinensis (A. Juss. ) Roem. 的叶子。采后冲洗并将叶片与叶轴分开,叶片在烘箱中于50 ℃烘至手可捏碎,粉碎过筛,收集过18目筛不过100目筛部分(过100目筛部分另外收集) ,放置干燥避光处密封保存备用。 实验
1.2.1、检测方法
采用分光光度法测定,以黄酮计的IC50值表示提取物清除DPPH自由基能力[ 11 ] 。IC50值的物理意义为:当抗氧化剂清除DPPH自由基达到50%清除率时,单位质量抗氧化剂所清除DPPH的质量。采用改进的AlCl3 显色分光光度法测定、计算超临界CO2 萃取物中的黄酮质量,标准曲线的制作如下:准确称取经105 ℃干燥至恒重的芦丁标准试剂01033 5 g,用体积分数为95%乙醇溶解,并定量转入100 mL容量瓶中,用体积分数95%乙醇定容,摇匀得质量浓度为01335 g•L - 1标准溶液。分别取上述芦丁标准溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、 410 mL于25 mL 容量瓶中,分别加入110 mL 015mol•L - 1三氯化铝水溶液,摇匀放置15 min,用体积分数95%乙醇定容至刻度,摇匀,超声振荡5 min后,选用1 cm比色皿在410 nm波长处测定其吸光度,参比为空白三氯化铝水溶液。以吸光度A 对芦丁质量浓度ρ作图,得图1校准曲线,其回归方程: A= 0.023 2ρ- 0.023 5, R2 = 0.999 8。线性范围的芦丁质量浓度为2.68～53.6 mg/L。根据此标准曲线的回归方程即可计算出试液的质量浓度和提取物中黄酮质量。
1.2.2、原料总黄酮含量和含水率的测定
称取5 g香椿叶2份,分别放入250 mL锥形瓶中,用体积分数为70%的乙醇作提取剂,第一次和第二次提取的溶剂用量为45 mL,第一次提取时间为90 min,以后每隔1 h提取一次,提取剂用量以刚好浸没料渣为宜,直到浸提液经显色反应后,其吸光度接近于0为止,参比为空白试剂。合并上述浸提液,采用AlCl3 显色分光光度法测定提取物中的黄酮量[ 12 ] 。计算得总黄酮量为171306 5 mg/g香椿叶。黄酮提取率=提取出的黄酮质量/香椿叶中总黄酮质量。
1.2.3、超临界萃取
确称取一定量的原料,装入料筒放进萃取釜,按工艺要求调节好萃取温度、CO2 流量,待制冷系统和萃取温度、CO2 流量等达到稳态后,加入设定种类和用量的夹带剂,开动高压泵进行循环萃取操作。从钢瓶出来的CO2 通过过滤系统、制冷系统后,经高压泵达到所需压力,由预热系统升至所需温度,然后与原料接触,被萃取成分溶解在CO2 中,萃取物流进入分离系统,通过改变压力或温度,降低其在超临界CO2 流体中的溶解度而被析出,萃取物用接收瓶接收后取样分析, CO2 气体经流量计计量后返回,再通过过滤系统、制冷系统循环利用。
1.2.4、超临界萃取的正交实验方法
在单因素实验的基础上,考虑安全性及经济性,固定无水乙醇为夹带剂,分离室Ⅰ温度35 ℃、压力7MPa;分离室Ⅱ温度35 ℃、压力与储罐平衡,再以萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量、CO2 流量为影响因素,采用正交实验确定各因素不同水平对萃取结果及IC50值的影响,选用L16 (45 )正交表进行实验方案设计。
1.2.5、超临界萃取的验证实验
在正交实验所得的最佳萃取工艺条件下,平行作两次验证实验。同时在此基础上作萃取次数为5次的单因素实验,寻找较佳的提取次数。
2、结果与讨论
极差分析
对以上正交实验结果作极差分析,结果如表2示 由表2可看出,各最佳水平按因素主次顺序排列为,黄酮提取量: A3 > E3 >D2 >B2 > C1 ;以总黄酮清除DPPH的IC50值: C4 >D4 > A4 > E4 > B3。分析各因素最佳水平顺序,以黄酮提取量为主,提取物以黄酮计的清除DPPH的IC50值为次参考指标综合考虑,可以得到在本实验条件下单次提取的最佳工艺:A3B2 C1D2 E3 ,即称取50 g原料,在分离室Ⅰ温度35℃、压力7MPa;分离室Ⅱ温度35 ℃、压力与储罐平衡条件下,以3 mL•g- 1加入无水乙醇做夹带剂,在萃取压力30MPa、萃取温度45 ℃、CO2 流量为35 L•h- 1循环萃取215 h。
3、结论
(1)超临界CO2 萃取香椿叶中黄酮类化合物时,单次提取各因素对黄酮提取量的影响大小次序为:萃取压力> CO2 流量>夹带剂用量>萃取温度>萃取时间。萃取压力对黄酮提取量影响显著,但对提取物以黄酮计的清除DPPH的IC50值的影响不显著;萃取温度、萃取时间、夹带剂用量、CO2 流量对黄酮提取量和提取物以黄酮计的清除DPPH的IC50值的影响不显著。
(2)在原料50 g,分离室Ⅰ温度35 ℃、压力7MPa;分离室Ⅱ温度35 ℃、压力与储罐平衡条件下,超临界CO2 萃取香椿叶中黄酮类化合物的最佳工艺条件为:萃取压力30MPa,萃取温度45 ℃,萃取时间215 h,夹带剂用量为3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用无水乙醇、后3次用体积分数85%的乙醇做夹带剂。在此条件下香椿叶黄酮提取量为81836 9 mg/g,总萃取率为51106%,提取物以黄酮计的清除DPPH自由基的IC50为51080 g•g- 1。